Rab 7 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-422571-ACT

Rab7 codifica a Rab7, uma pequena GTPase que regula a maturação de endossomos tardios, o tráfego endossomo–lisossomo e o posicionamento dos lisossomos por meio do recrutamento coordenado de efetores que controlam a motilidade de vesículas e a fusão de membranas. Em células de camundongo, a Rab7 é central para o fluxo autofágico ao promover a fusão entre autofagossomos e lisossomos e ao sustentar a degradação de cargas endocíticas, moldando assim a renovação de receptores e as vias de detecção de nutrientes. A interrupção do tráfego dependente de Rab7 perturba a homeostase lisossomal e pode influenciar o processamento de antígenos, o controle de qualidade mitocondrial e a sinalização neuroimune. Alterações na atividade de Rab7 têm sido associadas a mecanismos patológicos envolvendo neurodegeneração, neuropatia periférica e biologia de infecções, por meio de defeitos no tráfego intracelular e em vias degradativas.

Rab 7 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Rab7 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Rab 7 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Rab7 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Rab7, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Rab 7. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Rab7 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Rab 7 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Rab 7 em células tumorais com expressão de Rab7 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.