Rab 5C Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403247-ACT

O gene humano RAB5C codifica a Rab5C, uma pequena GTPase que regula a fusão de endossomos precoces, a endocitose mediada por receptores e a dinâmica do tráfego endossomal que molda a reciclagem de membrana e a duração da sinalização. Ao alternar entre os estados ligados a GDP e a GTP, a Rab5C coordena o recrutamento de efetores envolvidos no ancoramento de vesículas, na triagem de cargas e na remodelação de fosfoinositídeos, influenciando vias como a renovação (turnover) de receptores de fatores de crescimento e a captação de nutrientes. A atividade da família Rab5 interage com o transporte associado ao citoesqueleto e com o encaminhamento de endossomos para lisossomos, afetando processos como proliferação, polaridade e respostas a estímulos extracelulares. Alterações no tráfego endocítico e na sinalização dependente de Rab5 têm sido associadas à hiperativação de receptores relacionada ao câncer, a mecanismos neurodegenerativos ligados a déficits no transporte vesicular e à biologia de infecções, nas quais patógenos exploram rotas de entrada endossomais do hospedeiro.

Rab 5C O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RAB5C sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Rab 5C O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RAB5C em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RAB5C, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Rab 5C. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RAB5C nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Rab 5C no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Rab 5C em células tumorais com expressão de RAB5C silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.