Rab 5A CRISPR/Cas9 KO质粒 (h): sc-417949

概述

RAB5A 编码小型 GTP 酶 Rab 5A，它是早期内体动态变化的核心调控因子，负责协调网格蛋白介导的内吞作用、囊泡对接与融合以及内体运输。Rab 5A 通过在 GDP 结合态与 GTP 结合态之间循环切换，并与 EEA1、III 类 PI3K 复合物等效应蛋白相互作用，帮助控制内体成熟、受体再循环以及货物向降解途径的分选。Rab 5A 依赖的胞内运输会影响受体酪氨酸激酶和整合素的信号输出，将膜运输与调控增殖、迁移和细胞稳态的通路联系起来。RAB5A 活性失调及内吞通量改变与致癌信号的持续存在以及内溶酶体功能受损的神经退行性表型相关。

Rab 5A CRISPR/Cas9 敲除质粒（h）是一组质粒池，旨在针对性地破坏human细胞系中的RAB5A基因。该文库中的每个质粒均共表达一种独特的sgRNA，针对RAB5A基因座内的不同位点，同时表达来自化脓性链球菌的Cas9核酸酶，并编码GFP以实现对成功转染细胞的荧光识别和富集。这种多引导策略提高了诱导产生功能性敲除的移码突变或缺失的概率，为单引导策略提供了更可靠的替代方案。在多个位点诱导的双链断裂（DSBs）可通过非同源末端连接（NHEJ）修复，或者当与随附的HDR供体模板配合使用时，可在基因座内的特定靶位点通过同源导向修复（HDR）进行修复。

若与表达 RFP 的 HDR 供体结合使用，可同时利用 GFP 和 RFP 荧光区分转染细胞群与编辑后的细胞群，从而简化基于流式细胞术的分选和克隆筛选工作流程。

同源导向修复 (HDR) 供体 — 含 RFP 报告基因的嘌呤霉素抗性 cassete

对于需要确认且可筛选的敲除克隆的应用，Rab 5A HDR质粒（h）包含一个HDR供体构建体，其中含有嘧啶霉素抗性盒（PuroR）和红色荧光蛋白（RFP）报告基因，两侧由针对特定RAB5A靶位点的同源臂包围。
与 Rab 5A CRISPR/Cas9 敲除质粒（h）共转染时：

• PuroR-RFP 片段通过同源重组（HDR）整合到 Cas9 切割位点，从而破坏 RAB5A 的开放阅读框。
  RFP 荧光可作为整合成功的即时视觉指示，支持在嘌呤霉素筛选之前或同时，基于荧光对编辑后的细胞进行鉴定或分选。
  通过嘌呤霉素抗性可确认编辑成功的细胞，从而大幅减轻克隆筛选的工作量。
  该筛选策略非常适合构建稳定的克隆性敲除细胞系，用于下游的功能研究、药物筛选或模型开发。

Cre-lox 盒去除系统

HDR 供体构建体的loxP 位点位于 PuroR-RFP 选择盒的侧翼，可在克隆确认后干净利落地去除标记。通过随附的Cre 载体：sc-418923，瞬时表达 Cre 重组酶，切除基因盒，在RAB5A 基因座内留下最小的残留 loxP 位点，消除对下游检测的潜在干扰效应。
这种两步法

• 最大限度减少对局部染色质结构及邻近调控元件的干扰
  在编辑位点恢复近乎天然的基因组环境
  支持在同一细胞系中重复使用嘌呤霉素筛选策略进行后续编辑

主要特点

• gRNA靶向对Rab 5A功能至关重要的RAB5A外显子
  SpCas9与sgRNA由单一质粒共表达，简化递送流程
  含嘌呤霉素抗性的HDR供体，便于阳性克隆筛选
  由Cre重组酶载体携带的loxP夹杂PuroR盒，实现无缝标记去除
  提供转染即用型

仅供研究使用。不用于诊断或治疗。