Rab 11A CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400617-ACT

RAB11A kodiert die kleine GTPase Rab11A, einen zentralen Regulator der Dynamik von Recycling-Endosomen, der das Abschnüren von Vesikeln, ihren Transport und das Andocken an die Plasmamembran koordiniert. Rab11A steuert die polarisierte Membranlieferung, das Rezeptor-Recycling, die Zytokinese und die Bildung epithelialer Lumina, indem es Rab11-Familien-interagierende Proteine (FIPs) einbindet und an aktin- und mikrotubulusbasierte Motorproteine koppelt. Über diese Transportfunktionen beeinflusst Rab11A die Signalweiterleitung von Oberflächenrezeptoren und Integrinen und trägt zu endozytotischen Sortierentscheidungen bei, die Zellmigration und Polarität prägen. Eine fehlregulierte, Rab11A-abhängige Recycling-Route wurde mit Phänotypen in Verbindung gebracht, die für onkogene Transformation, neurodegenerative Prozesse und Wirt–Pathogen-Interaktionen relevant sind, bei denen Membranverkehr und Kompartimentierung gestört sind.

Rab 11A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RAB11A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Rab 11A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RAB11A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RAB11A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Rab 11A-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RAB11A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Rab 11A-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Rab 11A-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RAB11A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.