Rab 10 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-422551-ACT

Rab10 codifica a Rab10, uma pequena GTPase relacionada à Ras que coordena o tráfego de membranas ao regular o brotamento, o transporte, a ancoragem e a fusão de vesículas entre endossomos, vias de reciclagem e a rede trans-Golgi. Em células de camundongo, a atividade de Rab10 sustenta a exocitose polarizada, o tráfego de vesículas de GLUT4, a maturação de autofagossomos e a reciclagem de receptores, conectando-a à sinalização PI3K–AKT, à triagem endossomal e à dinâmica do citoesqueleto. A perturbação do tráfego dependente de Rab10 tem sido associada a alterações na responsividade à insulina, na função de células imunes e na homeostase neuronal, tornando Rab10 um nó útil para estudar, in vivo e em modelos cultivados, vias relevantes para o metabolismo e para a neurodegeneração.

Rab 10 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Rab10 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Rab 10 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Rab10 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Rab10, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Rab 10. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Rab10 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Rab 10 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Rab 10 em células tumorais com expressão de Rab10 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.