R2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400624-ACT

O RRM2 humano codifica a subunidade R2 da ribonucleotídeo redutase, uma enzima essencial que catalisa a conversão de ribonucleotídeos em desoxirribonucleotídeos, necessários para a replicação e o reparo do DNA. A R2 fornece o cofator radical tirosil-diférrico que sustenta o turnover catalítico, conectando assim o metabolismo de nucleotídeos à progressão da fase S e à manutenção do genoma. A expressão de RRM2 é rigidamente regulada por vias do ciclo celular e da resposta a danos no DNA, e sua desregulação é frequentemente associada a fenótipos proliferativos e estresse replicativo. Alterações na atividade de RRM2 têm sido estudadas em contextos de biologia tumoral, respostas antivirais e mecanismos que modulam o equilíbrio do pool de dNTPs e a mutagênese.

R2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RRM2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

R2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RRM2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RRM2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de R2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RRM2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de R2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via R2 em células tumorais com expressão de RRM2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.