R-type Ca++ CP α1E Plasmídeo CRISPR/Cas9 KO (m): sc-419404
- alvos específicos: mouse
- 20 µg de plasmídeo de DNA pronto para transfecção; Suficiente para até 20 transfecções
- R-type Ca++ CP α1E O Plasmídeo CRISPR/Cas9 Knockout (KO) (m) é um conjunto de plasmídeos, cada um codificando a nuclease Cas9 e um RNA guia (gRNA) de 20 nt específico para o alvo, concebido para uma eficiência máxima de knockout utilizando sequências derivadas da biblioteca GeCKO v2
- As sequências de gRNA direcionam a Cas9 para induzir quebras de cadeia dupla (DSBs) específicas do local no locus genómico R-type Ca++ CP α1E, resultando no knockout do gene através da junção de extremidades não homólogas (NHEJ)
- O Plasmídeo HDR R-type Ca++ CP α1E (m) (sc-419404-HDR) é recomendado para co-transfecção com o Plasmídeo CRISPR/Cas9 KO R-type Ca++ CP α1E (m) para permitir a seleção de células editadas com sucesso através da integração mediada por HDR de uma cassete de resistência à puromicina e do gene repórter RFP
- O Plasmídeo HDR R-type Ca++ CP α1E (m) é um conjunto de plasmídeos, cada um contendo um molde de reparação dirigida por homologia (HDR) correspondente aos locais-alvo do gRNA no Plasmídeo CRISPR/Cas9 KO R-type Ca++ CP α1E (m)
- Cada plasmídeo HDR contém dois braços de homologia de ~800 pb que flanqueiam as cassetes de resistência à puromicina e RFP, concebidos para se ligarem a sequências de ADN genómico que rodeiam o local da quebra de cadeia dupla induzida por Cas9 e facilitarem a integração precisa mediada por HDR
- Os genes de resistência à puromicina e RFP são flanqueados por sítios LoxP, permitindo a remoção de marcadores de seleção através da recombinase Cre (Cre Vector: sc-418923) após o estabelecimento de linhas celulares knockout estáveis
Informacoes sobre ordens
| Nome do Produto | Numero de Catalogo | UNID | Preco | Qde | FAVORITOS | |
R-type Ca++ CP α1E Plasmídeo CRISPR/Cas9 KO (m) | sc-419404 | 20 µg | $397.00 | |||
R-type Ca++ CP α1EPlasmídeo HDR (m) | sc-419404-HDR | 20 µg | $445.00 |
Visão geral
Cacna1e codifica a subunidade α1E formadora do poro dos canais de cálcio dependentes de voltagem do tipo R (CaV2.3), que medeiam o influxo de Ca2+ dependente da atividade em neurônios e células neuroendócrinas. O CaV2.3 contribui para a sinalização presináptica de cálcio, a transmissão sináptica e a regulação da excitabilidade ao acoplar a despolarização da membrana à liberação de neurotransmissores e a vias downstream dependentes de Ca2+, como a sinalização por CaMK e calcineurina. No sistema nervoso central, a atividade de canais associada ao CACNA1E se cruza com circuitos que governam o processamento da dor, a suscetibilidade a convulsões e fenótipos neuropsiquiátricos, por meio da modulação de padrões de disparo e da plasticidade sináptica. Assim, a disfunção do CaV2.3 é relevante para estudos mecanísticos de canalopatias de canais de cálcio e de alterações em nível de vias nas redes de sinalização neuronal.
O R-type Ca++ CP α1E CRISPR/Cas9 KO Plasmid (m) é um conjunto de plasmídeos concebido para a interrupção direcionada do gene Cacna1e em mouse linhas celulares. Cada plasmídeo do conjunto coexpressa um sgRNA único, direcionado a um local distinto dentro do locus Cacna1e, juntamente com a nuclease Cas9 de Streptococcus pyogenes, e codifica GFP para permitir a identificação fluorescente e o enriquecimento das células transfectadas com sucesso. Esta estratégia multiguia aumenta a probabilidade de induzir deslocamentos de quadro de leitura ou deleções que produzam um knockout funcional, oferecendo uma alternativa mais robusta às abordagens de guia único. As DSBs induzidas em múltiplos locais são resolvidas através da junção de extremidades não homólogas (NHEJ) ou, quando utilizadas com o modelo doador HDR incluído, através da reparação dirigida por homologia (HDR) num local-alvo definido dentro do locus.
Quando utilizado em conjunto com o doador HDR que expressa RFP, a fluorescência de GFP e RFP pode ser utilizada em conjunto para distinguir populações de células transfectadas das editadas, simplificando os fluxos de trabalho de triagem e seleção de clones baseados em citometria de fluxo.
Doador de Reparação Dirigida por Homologia (HDR) — Cassete de Puromicina com Repórter RFP
Para aplicações que requerem clones knockout confirmados e selecionáveis, o R-type Ca++ CP α1E Plasmídeo HDR (m) inclui uma construção doadora HDR contendo uma cassete de resistência à puromicina (PuroR) e um repórter de proteína fluorescente vermelha (RFP), flanqueados por braços de homologia específicos para um local-alvo definido Cacna1e.
Quando co-transfectado com o R-type Ca++ CP α1E Plasmídeo CRISPR/Cas9 KO (m):
- A cassete PuroR-RFP integra-se no local de corte da Cas9 através de HDR, interrompendo o quadro de leitura aberto Cacna1e.
A fluorescência da RFP fornece um indicador visual imediato do sucesso da integração, permitindo a identificação ou triagem baseada na fluorescência das células editadas antes ou em paralelo com a seleção por puromicina.
As células editadas com sucesso são confirmadas através da resistência à puromicina, reduzindo substancialmente a carga de triagem de clones.
Esta estratégia de seleção é ideal para gerar linhas celulares KO clonais estáveis para estudos funcionais a jusante, triagem de fármacos ou desenvolvimento de modelos.
Sistema de remoção de cassete Cre-lox
A construção doadora HDR apresenta sítios loxP flanqueando a cassete de seleção PuroR-RFP para permitir a remoção limpa do marcador após a confirmação do clone. A expressão transitória da recombinase Cre através do Vetor Cre: sc-418923 incluído excisa a cassete, deixando um local loxP residual mínimo dentro do locus Cacna1e e eliminando potenciais efeitos de confusão em ensaios a jusante.
Esta abordagem em duas etapas:
- Minimiza a perturbação da arquitetura local da cromatina e dos elementos reguladores vizinhos
Restaura um contexto genómico quase nativo no locus editado
Permite a reutilização da estratégia de seleção com puromicina na mesma linha celular para edições adicionais
Características principais
- gRNA direcionado para o(s) exão(ões) Cacna1e crítico(s) para a função R-type Ca++ CP α1E
Coexpressão de SpCas9 e sgRNA a partir de um único plasmídeo para uma entrega simplificada
Doador HDR com resistência à puromicina para seleção positiva de clones
Cassete PuroR flanqueada por loxP com vetor de recombinase Cre para remoção contínua do marcador
Fornecido pronto a usar para entrega por transfecção
Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.