PSS2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-424258-ACT

O gene Ptdss2 de camundongo codifica a fosfatidilserina sintase 2 (PSS2), uma enzima de membrana do retículo endoplasmático que catalisa a produção de fosfatidilserina (PS) por meio de uma reação de troca de base utilizando a fosfatidiletanolamina. Ao controlar os estoques celulares de PS, a PSS2 contribui para a biogênese de membranas, a homeostase lipídica e a função de organelas, com efeitos a jusante em processos como o tráfego vesicular, a fisiologia mitocondrial e a sinalização relacionada à apoptose, nos quais a distribuição de PS é crítica. A perturbação da biossíntese de PS pode alterar a composição de membrana e redes de sinalização ligadas à adaptação metabólica e às respostas ao estresse, tornando a regulação de Ptdss2 relevante para estudos mecanísticos de fenótipos celulares dependentes de lipídios. Como um nó central no metabolismo de glicerofosfolipídios, a PSS2 oferece um ponto de entrada acessível para investigar como a composição lipídica de membrana influencia o estado celular e vias associadas a doenças.

PSS2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Ptdss2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PSS2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Ptdss2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Ptdss2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PSS2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Ptdss2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PSS2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PSS2 em células tumorais com expressão de Ptdss2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.