PREP-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402314-ACT

PKNOX1 codifica o fator de transcrição homeobox TALE humano PREP-1, uma proteína nuclear de ligação ao DNA que atua em parceria com cofatores das famílias PBX e MEIS para regular a atividade de enhancers e promotores durante o desenvolvimento e as decisões de destino celular. O PREP-1 contribui para programas transcricionais que controlam diferenciação, proliferação e homeostase metabólica, e sua atividade se integra a redes gênicas mais amplas reguladas por homeobox. A expressão desregulada de PKNOX1/PREP-1 tem sido associada a alterações na especificação de linhagens e a estados transcricionais oncogênicos em múltiplos contextos, o que sustenta seu uso como um nó para estudar o controle transcricional em modelos relevantes para doenças. Como regulador associado à cromatina, o PREP-1 também é pertinente para investigações da arquitetura regulatória gênica e da função de enhancers dependente do contexto.

PREP-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PKNOX1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PREP-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PKNOX1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PKNOX1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PREP-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PKNOX1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PREP-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PREP-1 em células tumorais com expressão de PKNOX1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.