PPP2R3A Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402433-ACT

PPP2R3A codifica uma subunidade regulatória B″/PR72 da proteína fosfatase 2A (PP2A), uma importante fosfatase de serina/treonina que molda a sinalização por fosforilação ao direcionar o reconhecimento de substratos e o direcionamento subcelular do holoenzima PP2A. Por meio do controle dependente de PP2A do equilíbrio entre quinases e fosfatases, PPP2R3A está implicado na coordenação da progressão do ciclo celular, das respostas a danos no DNA e de programas mais amplos de transdução de sinais que influenciam o metabolismo e a adaptação ao estresse. Alterações na composição das subunidades regulatórias de PP2A são frequentemente associadas a redes de fosforilação desreguladas observadas em distúrbios proliferativos e neurobiológicos, tornando PPP2R3A relevante para dissecar o redirecionamento (rewiring) de vias. Assim, modular a expressão de PPP2R3A é útil para estudar a regulação mediada por fosfatases de nós de crescimento e sinalização em modelos celulares humanos.

PPP2R3A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PPP2R3A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PPP2R3A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PPP2R3A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PPP2R3A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PPP2R3A. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PPP2R3A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PPP2R3A no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PPP2R3A em células tumorais com expressão de PPP2R3A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.