PP2Cκ Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-433975-ACT

Ppm1k codifica a fosfatase mitocondrial PP2Cκ, uma enzima da família PP2C dependente de Mg2+/Mn2+ que regula o metabolismo oxidativo ao desfosforilar alvos-chave envolvidos no catabolismo de aminoácidos de cadeia ramificada (BCAA). Em particular, a PP2Cκ modula a atividade do complexo desidrogenase de α-cetoácidos de cadeia ramificada (BCKDH), conectando o fluxo de nutrientes mitocondrial à homeostase energética celular. Por meio de seus efeitos sobre a utilização de BCAA e a função mitocondrial, Ppm1k é estudado em contextos de respostas ao estresse metabólico e de bioenergética específica de tecidos, incluindo modelos relevantes para sensibilidade à insulina, metabolismo do tecido adiposo e muscular e fenótipos associados à disfunção mitocondrial. A desregulação dessa via está associada a alterações na homeostase de aminoácidos e a estados de sinalização relacionados a doenças metabólicas em sistemas experimentais.

PP2Cκ O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Ppm1k sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PP2Cκ O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Ppm1k em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Ppm1k, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PP2Cκ. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Ppm1k nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PP2Cκ no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PP2Cκ em células tumorais com expressão de Ppm1k silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.