Plasmide CRISPR d'Activation (h) PP2A-B56-δ: sc-403020-ACT

PPP2R5D code la sous-unité régulatrice B56δ de la protéine phosphatase 2A (PP2A), une phosphatase majeure des sérines/thréonines qui façonne la signalisation par phosphorylation en orientant la sélectivité des substrats et la localisation subcellulaire de l’holoenzyme PP2A. PP2A‑B56δ contribue au contrôle de la progression du cycle cellulaire, de la signalisation des dommages à l’ADN et de la fidélité du point de contrôle mitotique en modulant l’état de phosphorylation de nœuds clés des voies, influençant ainsi la prolifération et les réponses au stress. En ajustant, de manière dépendante de PP2A, des réseaux pilotés par des kinases tels que MAPK/ERK et PI3K/AKT, PPP2R5D aide à maintenir l’homéostasie de la signalisation et des programmes transcriptionnels associés à la différenciation et à la survie. La dérégulation ou la mutation de sous-unités régulatrices de PP2A, dont PPP2R5D, est associée à des paysages de phosphorylation modifiés pertinents pour la biologie des cancers et des phénotypes neurodéveloppementaux, ce qui soutient son utilisation comme cible mécanistique dans des études axées sur les voies de signalisation.

PP2A-B56-δ Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PPP2R5D sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PP2A-B56-δ Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PPP2R5D dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PPP2R5D, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PP2A-B56-δ. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PPP2R5D natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PP2A-B56-δ au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PP2A-B56-δ dans les cellules tumorales présentant une expression de PPP2R5D silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.