Pol II CRISPR Activationプラスミド (h): sc-400053-ACT

POLR2Aは、mRNAおよび多くの非コードRNAを合成し、プロモーター近傍でのポーズ、伸長、転写共役的RNAプロセシングを統合する中核酵素であるヒトRNAポリメラーゼII（Pol II）の最大サブユニットをコードしています。Pol IIの機能は、C末端ドメインのリン酸化を伴う転写サイクルを通じて協調的に制御され、転写をスプライシング、5′キャッピング、3′末端形成と結び付けるとともに、遺伝子発現プログラムをクロマチン制御やDNA損傷応答と連関させます。転写制御の中心的ハブとして、POLR2Aは全体的な転写出力や細胞のストレス適応を評価する参照としてしばしば利用されます。Pol II活性の変化および転写制御の破綻は、がん性の転写状態や神経発達に関わる表現型と広く関連しており、POLR2Aは遺伝子制御の機構研究において重要な標的となります。

Pol II CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性POLR2Aの発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

Pol II CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における POLR2A 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はPOLR2A転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性Pol IIの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のPOLR2A遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるPol II依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびPOLR2A発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるPol II経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。