PNPase Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404406-ACT

PNPT1 codifica a polirribonucleótido nucleotidiltransferase 1 (PNPase), uma exorribonuclease conservada 3′–5′ e uma enzima do tipo poli(A) polimerase que se localiza predominantemente nas mitocôndrias e regula a degradação (turnover) e a vigilância de RNA. A PNPase participa no processamento de RNA mitocondrial, na manutenção da expressão génica mitocondrial e no controlo da homeostase de RNA no citosol e nas mitocôndrias, com impacto na fosforilação oxidativa e no metabolismo energético celular. A disrupção da função de PNPT1 tem sido associada a fenótipos de disfunção mitocondrial e é estudada no contexto de perturbações do neurodesenvolvimento e de doenças neuromusculares, bem como de vias mais abrangentes envolvendo respostas ao stress mitocondrial e ativação da imunidade inata desencadeada por espécies de RNA aberrantes.

PNPase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PNPT1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PNPase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PNPT1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PNPT1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PNPase. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PNPT1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PNPase no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PNPase em células tumorais com expressão de PNPT1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.