PMS2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401600-ACT

PMS2 codifica um componente central da maquinaria de reparo de incompatibilidades do DNA (MMR), que forma o heterodímero MutLα com MLH1 para detectar e resolver incompatibilidades base–base e alças de inserção/deleção que surgem durante a replicação do DNA. Por meio da coordenação dependente de ATP da atividade endonuclease, da excisão e da ressíntese, PMS2 ajuda a preservar a estabilidade do genoma e a limitar a carga mutacional em populações celulares em proliferação. A disfunção ou a atividade reduzida de PMS2 está associada a fenótipos de instabilidade de microssatélites e é frequentemente estudada no contexto de síndromes hereditárias de predisposição ao câncer e da evolução tumoral impulsionada por reparo de DNA defeituoso. Como resultado, PMS2 é amplamente utilizado para investigar a fidelidade da replicação, a comunicação cruzada da resposta a danos no DNA e os mecanismos que moldam os espectros de mutação.

PMS2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PMS2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PMS2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PMS2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PMS2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PMS2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PMS2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PMS2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PMS2 em células tumorais com expressão de PMS2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.