PMCA4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402888-ACT

ATP2B4 codifica a Ca2+-ATPase 4 da membrana plasmática (PMCA4), uma ATPase do tipo P de alta afinidade que exporta Ca2+ citosólico para manter a homeostase do cálcio e moldar sinais de Ca2+ no espaço e no tempo. Ao ajustar a dinâmica intracelular de Ca2+, a PMCA4 influencia o acoplamento excitação–contração, a sinalização de óxido nítrico por sua proximidade com a sintase de óxido nítrico endotelial e programas transcricionais a jusante controlados por vias responsivas ao Ca2+, como calcineurina–NFAT e sinalização por CaMK. A atividade da PMCA4 contribui para a regulação do potencial de membrana, da migração celular e da susceptibilidade à apoptose por meio do controle de enzimas e canais iônicos dependentes de Ca2+. A desregulação da expressão ou da função de ATP2B4/PMCA4 tem sido associada, em estudos genéticos e mecanísticos, a fenótipos cardiovasculares e eritroides, apoiando sua relevância para modelar a biologia dirigida por Ca2+ em células humanas.

PMCA4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ATP2B4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PMCA4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ATP2B4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ATP2B4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PMCA4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ATP2B4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PMCA4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PMCA4 em células tumorais com expressão de ATP2B4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.