plexin-B1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401840-ACT

PLXNB1 codifica a plexina-B1, um receptor transmembranar para semaforinas da classe 4 que coordena a sinalização dependente de contato para regular a remodelação do citoesqueleto, a migração celular direcional e o guiamento axonal. A plexina-B1 integra sinais por meio de GTPases da família Rho e de efetores associados para influenciar a dinâmica da actina, a renovação das adesões e programas de polaridade celular, com impactos a jusante na padronização tecidual e na organização de barreiras. Na biologia humana, alterações na expressão ou na sinalização de PLXNB1 têm sido associadas à motilidade desregulada e ao comportamento invasivo em modelos de câncer, bem como a processos do neurodesenvolvimento nos quais as vias semaforina–plexina moldam a conectividade neuronal. Essas características tornam a plexina-B1 um ponto útil para estudar a sinalização por semaforinas, a remodelação ligada a Rho/ROCK e mudanças dependentes do contexto nas interações célula–célula e célula–matriz.

plexin-B1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PLXNB1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

plexin-B1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PLXNB1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PLXNB1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de plexin-B1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PLXNB1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de plexin-B1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via plexin-B1 em células tumorais com expressão de PLXNB1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.