PIWIL2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402211-ACT

PIWIL2 (HIWI2) codifica uma proteína Argonaute da subfamília PIWI que se liga a piRNAs e contribui para o silenciamento de elementos transponíveis guiado por pequenos RNAs, sustentando a integridade do genoma em contextos de linhagem germinativa e semelhantes à linhagem germinativa. Por meio de sua participação na biogênese de piRNAs e na regulação epigenética, PIWIL2 influencia o estado da cromatina, os padrões de metilação do DNA e o controle pós-transcricional de RNAs-alvo. A expressão aberrante de PIWIL2 foi relatada em múltiplos tipos de câncer e é frequentemente estudada em associação com fenótipos de células-tronco tumorais, programas de proliferação e redes de sinalização relacionadas à resistência. Essas características tornam PIWIL2 um nó útil para dissecar vias de regulação gênica mediadas por RNA e de defesa do genoma em células humanas.

PIWIL2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PIWIL2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PIWIL2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PIWIL2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PIWIL2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PIWIL2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PIWIL2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PIWIL2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PIWIL2 em células tumorais com expressão de PIWIL2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.