Pin1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400485-ACT

PIN1 codifica la peptidil-prolil cis/trans isomerasi 1 interagente con NIMA (Pin1), un’isomerasi proilica dipendente dalla fosforilazione che riconosce motivi Ser/Thr‑Pro e rimodella le proteine bersaglio dopo la fosforilazione. Accoppiando i cambiamenti conformazionali allo stato delle modifiche post-traduzionali, Pin1 regola la progressione del ciclo cellulare, i programmi trascrizionali, la segnalazione del danno al DNA e la proteostasi attraverso molteplici vie guidate da chinasi. L’attività di Pin1 può influenzare la stabilità e la funzione di regolatori chiave come p53, le cicline e fattori di trascrizione, collegandola al controllo della proliferazione e delle risposte allo stress. Un’espressione o un’attività deregolata di PIN1 è stata associata a segnalazione oncogenica e a processi neurodegenerativi, rendendola un bersaglio utile per studi meccanicistici della regolazione dipendente dalla fosforilazione.

Pin1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PIN1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Pin1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PIN1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PIN1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Pin1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PIN1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Pin1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Pin1 nelle cellule tumorali con espressione di PIN1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.