PICK1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403683-ACT

A PICK1 humana (proteína interagente com a proteína quinase C 1) é uma proteína de suporte (scaffold) contendo domínios PDZ e BAR, que acopla o sensoriamento de curvatura de membrana ao tráfego de receptores e à transdução de sinais. A PICK1 regula a endocitose, a reciclagem e a localização sináptica de diversas proteínas de membrana, incluindo receptores de glutamato do tipo AMPA e transportadores, influenciando a plasticidade sináptica e a sinalização intracelular por quinases. Por meio de seus papéis no tráfego vesicular e na organização do citoesqueleto, a PICK1 participa da comunicação neuronal e de processos de transporte polarizado em múltiplos tipos celulares. Vias associadas à PICK1 desreguladas têm sido investigadas no contexto de disfunção neurológica e de alterações na homeostase de receptores, tornando-a um nó útil para o estudo de redes de sinalização próximas à membrana.

PICK1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PICK1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PICK1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PICK1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PICK1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PICK1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PICK1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PICK1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PICK1 em células tumorais com expressão de PICK1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.