pHyde Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405526-ACT

STEAP3 (pHyde) codifica um membro da família de antígenos epiteliais de próstata com seis domínios transmembrana que atua como ferrirredutase, catalisando a redução de Fe³⁺ para Fe²⁺ para sustentar a captação e a utilização de ferro pela célula. É enriquecido em compartimentos endossomais e se integra ao tráfego de transferrina, à homeostase do ferro e ao equilíbrio redox, influenciando assim o metabolismo mitocondrial e o controle de espécies reativas de oxigênio. A atividade desregulada de STEAP3 tem sido associada a alterações no manejo do ferro e a programas de estresse oxidativo observados em múltiplos contextos de doença, incluindo biologia de neoplasias hematológicas e tumores sólidos. Como regulador humano do metabolismo do ferro, STEAP3 é frequentemente estudado em vias que governam a suscetibilidade à ferroptose, a sinalização inflamatória e a adaptação metabólica sob estresse.

pHyde O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de STEAP3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

pHyde O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus STEAP3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição STEAP3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de pHyde. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus STEAP3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de pHyde no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via pHyde em células tumorais com expressão de STEAP3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.