PFK-2/PFKFB2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401358-ACT

PFKFB2 codifica a 6-fosfofruto-2-quinase/frutose-2,6-bisfosfatase 2 (PFK-2/PFKFB2), uma enzima bifuncional que controla os níveis celulares de frutose-2,6-bisfosfato, um potente ativador alostérico da PFK-1 e do fluxo glicolítico. Ao ajustar o equilíbrio entre a glicólise e o potencial gluconeogénico, a PFKFB2 liga a disponibilidade de nutrientes à produção de ATP, à homeostase redox e ao fornecimento de precursores biossintéticos. A sua atividade integra-se com a sinalização insulina/PI3K–AKT e com vias de quinases responsivas ao stress que modulam a adaptação metabólica. A expressão desregulada de PFKFB2 ou a sua regulação dependente de sinalização tem sido associada a alterações na reprogramação metabólica observadas em diversos modelos de doenças cardiometabólicas e proliferativas, tornando-a um nó útil para estudar fenótipos centrados na glicólise.

PFK-2/PFKFB2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PFKFB2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PFK-2/PFKFB2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PFKFB2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PFKFB2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PFK-2/PFKFB2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PFKFB2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PFK-2/PFKFB2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PFK-2/PFKFB2 em células tumorais com expressão de PFKFB2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.