PERK Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400080-ACT

EIF2AK3 codifica a PERK, uma quinase transmembranar residente no retículo endoplasmático (RE) que detecta o acúmulo de proteínas mal dobradas e inicia a resposta a proteínas mal dobradas (UPR). Sob estresse do RE, a PERK fosforila a eIF2α para atenuar a tradução global, ao mesmo tempo que promove programas transcricionais de adaptação ao estresse, integrando-se à sinalização da ISR, ao controle redox e à autofagia. A atividade da PERK molda decisões de destino celular entre adaptação e apoptose por meio de crosstalk com ATF4/CHOP e outros ramos da UPR, influenciando a proteostase e a reprogramação metabólica. A desregulação da sinalização de PERK tem sido implicada em condições que envolvem estresse crônico do RE, incluindo neurodegeneração, disfunção de células β relacionada ao diabetes e tolerância ao estresse associada ao câncer.

PERK O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de EIF2AK3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PERK O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus EIF2AK3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição EIF2AK3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PERK. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus EIF2AK3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PERK no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PERK em células tumorais com expressão de EIF2AK3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.