periplakin Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402350-ACT

O PPL humano codifica a periplaquina, um citoligador da família das plaquinas que conecta filamentos intermediários aos desmossomos e ao envelope cornificado, sustentando a estabilidade mecânica de epitélios e endotélios. A periplaquina participa da montagem de desmossomos, da organização da rede de queratinas e da remodelação do citoesqueleto durante a diferenciação e em respostas a feridas, podendo também influenciar saídas de sinalização ligadas à adesão celular e a vias de estresse. Alterações na expressão ou na localização de PPL foram relatadas em múltiplas patologias epiteliais, incluindo distúrbios inflamatórios da pele e cânceres, nos quais mudanças na integridade das junções célula–célula e no comportamento migratório são relevantes. Como plataforma (scaffold) na periferia celular, a periplaquina é frequentemente estudada na formação de barreira, na polaridade epitelial e na regulação dependente de junções da proliferação e da invasão.

periplakin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PPL sem alterar a sequência de ADN subjacente.

periplakin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PPL em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PPL, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de periplakin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PPL nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de periplakin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via periplakin em células tumorais com expressão de PPL silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.