PEPCK-C/PCK1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-422131-ACT

O gene murino **Pck1** codifica a fosfoenolpiruvato carboxiquinase citosólica (PEPCK-C), uma enzima limitante da taxa na gliconeogênese que converte oxaloacetato em fosfoenolpiruvato e conecta intermediários do ciclo do TCA à produção de glicose. A PEPCK-C integra sinais hormonais e nutricionais para coordenar a produção hepática de glicose e o fluxo mais amplo de carbono por meio da glicólise/gliconeogênese e de vias anapleróticas/catapleróticas. Alterações na regulação de **Pck1** são frequentemente usadas como um marcador molecular de adaptação metabólica, incluindo respostas ao jejum, sinalização de insulina e glucagon e mudanças no ciclo de substratos mitocondrial–citosólico. A expressão desregulada de **Pck1** é relevante para fenótipos metabólicos como resistência à insulina, esteatose hepática e homeostase glicêmica prejudicada em modelos murinos.

PEPCK-C/PCK1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Pck1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PEPCK-C/PCK1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Pck1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Pck1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PEPCK-C/PCK1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Pck1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PEPCK-C/PCK1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PEPCK-C/PCK1 em células tumorais com expressão de Pck1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.