PEPCK-C/PCK1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401295-ACT

O PCK1 humano codifica a fosfoenolpiruvato carboxiquinase citosólica (PEPCK-C), uma enzima limitante da velocidade na gliconeogênese que catalisa a conversão de oxaloacetato em fosfoenolpiruvato utilizando GTP. A PEPCK-C integra a produção hepática e renal de glicose ao metabolismo central do carbono, conectando intermediários do ciclo do TCA (ciclo do ácido tricarboxílico) a fluxos glicolíticos e anapleróticos. Sua expressão é rigidamente regulada por sinais hormonais e nutricionais por meio de redes transcricionais que envolvem a sinalização por cAMP/PKA, vias de resposta a glicocorticoides e repressão dependente de insulina. A atividade desregulada do PCK1 e seu controle transcricional são amplamente estudados em contextos de doenças metabólicas, incluindo resistência à insulina, biologia da esteatose hepática e reprogramação metabólica tumoral.

PEPCK-C/PCK1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PCK1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PEPCK-C/PCK1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PCK1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PCK1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PEPCK-C/PCK1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PCK1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PEPCK-C/PCK1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PEPCK-C/PCK1 em células tumorais com expressão de PCK1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.