PDE4D Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-433646-ACT

O gene Pde4d de camundongo codifica a fosfodiesterase 4D (PDE4D), uma fosfodiesterase específica para cAMP que hidrolisa cAMP em 5′-AMP e molda a amplitude e a restrição espacial da sinalização dependente de PKA e EPAC. Ao regular o tônus intracelular de segundos mensageiros, a PDE4D influencia respostas mediadas por GPCR, programas transcricionais como a sinalização de CREB e processos que incluem proliferação celular, diferenciação e modulação imune. A atividade da PDE4D é integrada à sinalização compartimentalizada por meio de proteínas de ancoragem da A-quinase e pode afetar a dinâmica da via MAPK/ERK por meio de crosstalk com efetores de cAMP. A desregulação do turnover de cAMP mediado por PDE4D tem sido implicada em inflamação e em fenótipos neurobiológicos, sustentando seu uso como um nó mecanístico em estudos de sinalização relevantes para doenças em modelos murinos.

PDE4D O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Pde4d sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PDE4D O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Pde4d em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Pde4d, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PDE4D. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Pde4d nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PDE4D no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PDE4D em células tumorais com expressão de Pde4d silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.