PDC-E2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402520-ACT

O DLAT humano codifica a PDC‑E2 (dihidrolipoamida acetiltransferase), a subunidade central E2 do complexo mitocondrial piruvato desidrogenase, que direciona o piruvato derivado da glicólise para o ciclo do TCA (Krebs) ao gerar acetil‑CoA. Essa enzima dependente de lipoato sustenta o fluxo central de carbono, o equilíbrio redox e o metabolismo energético mitocondrial, acoplando funcionalmente a oxidação do piruvato à capacidade respiratória. A atividade de DLAT/PDC‑E2 cruza com a deteção de nutrientes e com respostas ao stress oxidativo por meio do seu impacto na produção de NADH e no subsequente transporte de elétrons. A desregulação de componentes do complexo piruvato desidrogenase está associada ao remodelamento metabólico observado em contextos de câncer e de neurodegeneração, e a PDC‑E2 também é relevante para estudos da biologia de autoantígenos mitocondriais.

PDC-E2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de DLAT sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PDC-E2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus DLAT em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição DLAT, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PDC-E2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus DLAT nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PDC-E2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PDC-E2 em células tumorais com expressão de DLAT silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.