PD-ECGF Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403836-ACT

TYMP codifica a timidina fosforilase, também conhecida como fator de crescimento de células endoteliais derivado de plaquetas (PD-ECGF), uma enzima citosólica que catalisa a fosforólise da timidina e da desoxiuridina para regular os reservatórios de nucleosídeos e a via de recuperação de nucleotídeos (salvamento). Por meio do seu impacto no metabolismo de pirimidinas, o TYMP influencia respostas ao estresse de replicação do DNA, o equilíbrio de nucleotídeos mitocondriais e, de forma mais ampla, a homeostase redox e metabólica celular. A atividade do PD-ECGF tem sido associada à biologia endotelial e à remodelação tecidual por efeitos de sinalização mediados por metabólitos, conectando o metabolismo de nucleosídeos a programas angiogênicos. A desregulação da expressão ou da função de TYMP está associada a alterações no metabolismo de nucleotídeos observadas em distúrbios proliferativos e mitocondriais, sustentando seu uso como alvo em estudos mecanísticos em modelos de doenças associadas ao metabolismo.

PD-ECGF O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TYMP sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PD-ECGF O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TYMP em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TYMP, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PD-ECGF. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TYMP nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PD-ECGF no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PD-ECGF em células tumorais com expressão de TYMP silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.