PC-PLD1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402528-ACT

O PLD1 humano codifica a fosfolipase D1 (PC-PLD1), uma enzima associada à membrana que hidrolisa a fosfatidilcolina para gerar ácido fosfatídico, um segundo mensageiro lipídico que regula o tráfego de membranas, a remodelação do citoesqueleto e a secreção de vesículas. O ácido fosfatídico derivado de PLD1 influencia vias de transdução de sinal, incluindo mTOR e redes de pequenas GTPases (ARF e a família Rho), moldando assim a endocitose, a exocitose e a reciclagem de receptores. Por suas funções na ativação plaquetária, na sinalização inflamatória e em respostas induzidas por fatores de crescimento, o PLD1 tem sido estudado em contextos como invasão de células tumorais, biologia da trombose e neuroinflamação. Alterações na atividade de PLD1 e na dinâmica da sinalização lipídica também estão associadas a mudanças na autofagia e em respostas ao estresse mitocondrial, tornando-o um alvo útil para estudos mecanísticos da homeostase celular.

PC-PLD1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PLD1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PC-PLD1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PLD1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PLD1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PC-PLD1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PLD1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PC-PLD1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PC-PLD1 em células tumorais com expressão de PLD1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.