PARD6B Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401699-ACT

O gene humano **PARD6B** codifica a Par-6 beta, um andaime de polaridade com domínio PDZ que monta o complexo de polaridade PAR com PAR3 e aPKC (PKC atípica) para estabelecer a polaridade ápico–basal e coordenar a formação de junções estreitas (tight junctions). Por meio de interações com pequenas GTPases como CDC42 e RAC1, o PARD6B ajuda a regular a dinâmica do citoesqueleto, a divisão celular orientada e a morfogênese epitelial, com efeitos a jusante sobre a migração e a arquitetura tecidual. Sinalização de polaridade alterada envolvendo PARD6B tem sido associada à desorganização epitelial e a fenótipos invasivos em contextos relevantes para o câncer, e o gene também é estudado em processos de desenvolvimento e na função de barreira. Como um hub de sinalização em junções célula–célula, o PARD6B oferece um ponto de entrada acessível para dissecar programas transcricionais e fenótipos dependentes de polaridade.

PARD6B O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PARD6B sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PARD6B O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PARD6B em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PARD6B, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PARD6B. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PARD6B nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PARD6B no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PARD6B em células tumorais com expressão de PARD6B silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.