PARD3B Plasmídeo de ativação de CRISPR (h2): sc-406097-ACT-2

O gene humano PARD3B codifica o partitioning defective 3 homolog B, uma proteína de suporte (scaffold) de polaridade que se localiza nas junções célula–célula e coordena a montagem de complexos de polaridade ápico-basal com parceiros como a PKC atípica e outras proteínas PAR. Por meio de interações mediadas por domínios PDZ, o PARD3B ajuda a regular a organização das junções ocludentes, a morfogênese epitelial e a migração direcional, integrando sinais provenientes do citoesqueleto e de vias de sinalização de pequenas GTPases. Alterações na função da rede de polaridade e na integridade das junções envolvendo o PARD3B têm sido implicadas em processos relevantes para a progressão tumoral, a invasão e a disfunção da barreira epitelial. A edição gênica de PARD3B permite estudos mecanísticos da sinalização dependente de polaridade, da dinâmica das junções e de transições de estado celular em modelos de células humanas, usando abordagens de knockout, knock-in ou perturbações específicas de domínio.

PARD3B O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h2) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PARD3B sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PARD3B O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h2) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PARD3B em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PARD3B, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PARD3B. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PARD3B nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PARD3B no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PARD3B em células tumorais com expressão de PARD3B silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.