PAR-4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401719-ACT

F2RL3 codifica o receptor ativado por proteases 4 (PAR-4), um receptor acoplado à proteína G ativado pela trombina e por outras proteases de serina por meio do desmascaramento proteolítico de um ligante ancorado. A sinalização do PAR-4 envolve as vias Gq e G12/13 para estimular a atividade da fosfolipase C, a mobilização de Ca2+ intracelular, a sinalização RhoA/ROCK e programas transcricionais a jusante mediados por MAPK e NF-κB. Em plaquetas e em células associadas ao sistema vascular, essas cascatas regulam a ativação, a secreção, a remodelação do citoesqueleto e a comunicação cruzada inflamatória. A atividade desregulada do PAR-4 e padrões de expressão de F2RL3 têm sido associados a processos biológicos relevantes para trombose, inflamação vascular e sinalização do microambiente relacionada ao câncer, sustentando estudos mecanísticos em hemostasia e em interações tumor–estroma.

PAR-4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de F2RL3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PAR-4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus F2RL3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição F2RL3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PAR-4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus F2RL3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PAR-4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PAR-4 em células tumorais com expressão de F2RL3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.