PAP-α Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403906-ACT

PAPOLA codifica a polimerase poli(A) alfa (PAP-α), uma enzima central do processamento da extremidade 3′ do mRNA que catalisa a poliadenilação após a clivagem do pré‑mRNA. Ao definir o comprimento da cauda poli(A) e apoiar a montagem de proteínas de ligação à poli(A), a PAP-α influencia a estabilidade do mRNA, a exportação nuclear e a eficiência de tradução em diversos programas gênicos. A PAPOLA atua no maquinário de clivagem e poliadenilação e se conecta a vias de controle de qualidade de RNA e de processamento de RNA acoplado à transcrição. A desregulação do processamento da extremidade 3′ e do controle da cauda poli(A) está associada a estados de expressão gênica alterados observados em contextos proliferativos e de adaptação ao estresse, sustentando a investigação de PAPOLA no remodelamento do transcriptoma relevante para doenças.

PAP-α O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PAPOLA sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PAP-α O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PAPOLA em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PAPOLA, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PAP-α. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PAPOLA nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PAP-α no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PAP-α em células tumorais com expressão de PAPOLA silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.