PAM Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404391-ACT

O PAM humano codifica a monooxigenase alfa-amidante de peptidilglicina, uma enzima bifuncional dependente de cobre e ascorbato que catalisa a amidificação C-terminal de hormonas peptídicas e neuropéptidos, uma etapa de maturação essencial para a bioatividade. O PAM localiza-se principalmente na via secretora, ligando a exocitose regulada ao processamento de peptídeos e sustentando a sinalização neuroendócrina e neuronal. Ao controlar os reservatórios de peptídeos amidificados, o PAM influencia vias de comunicação celular que modulam o metabolismo, as respostas ao stress e a função sináptica. Alterações na expressão ou atividade de PAM têm sido associadas a desregulação neuroendócrina e a fenótipos de doenças neurológicas, tornando-o relevante para estudos de biologia de grânulos secretores e de sinalização mediada por peptídeos.

PAM O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PAM sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PAM O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PAM em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PAM, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PAM. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PAM nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PAM no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PAM em células tumorais com expressão de PAM silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.