PAC-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401917-ACT

A fosfatase de proteína de dupla especificidade 2 (DUSP2), também conhecida como PAC-1, é uma fosfatase de MAPK que desfosforila ERK e p38 ativadas para atenuar a sinalização responsiva a mitógenos e ao estresse. Ao modular a amplitude e a duração das cascatas de MAPK, a DUSP2 influencia programas transcricionais que controlam a ativação de células imunes, as respostas a citocinas e a proliferação. Alterações na expressão de DUSP2 têm sido relatadas em contextos inflamatórios e em múltiplos tipos de câncer, em consonância com efeitos dependentes do contexto sobre crescimento e diferenciação mediados por MAPK. Como uma fosfatase enriquecida no núcleo, a PAC-1 oferece um ponto útil para investigar a regulação por feedback na sinalização proximal a receptores e nas redes de expressão gênica a jusante.

PAC-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de DUSP2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PAC-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus DUSP2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição DUSP2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PAC-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus DUSP2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PAC-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PAC-1 em células tumorais com expressão de DUSP2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.