PA200 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404513-ACT

PSME4 codifica a PA200, um ativador do proteassoma que se associa à partícula central 20S para modular a abertura do “portão” do proteassoma e o processamento de peptídeos. A PA200 está implicada na degradação proteassomal independente de ubiquitina e é frequentemente ligada à proteostase nuclear, incluindo a regulação da renovação de proteínas associadas à cromatina durante respostas a dano no DNA e processos associados à espermatogênese. Ao moldar a atividade do proteassoma, a PA200 pode influenciar vias que controlam a progressão do ciclo celular, a estabilidade genômica e a remodelação do proteoma adaptativa ao estresse. Alterações na expressão de PSME4 foram relatadas em múltiplos contextos de doença nos quais a proteostase e o reparo do DNA estão perturbados, sustentando seu estudo como um nó mecanístico no controle de qualidade de proteínas e na sinalização nuclear de estresse.

PA200 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PSME4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PA200 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PSME4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PSME4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PA200. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PSME4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PA200 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PA200 em células tumorais com expressão de PSME4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.