p54/nrb Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-424729-ACT

O gene Nono de camundongo codifica p54/nrb (NONO), uma proteína nuclear multifuncional de ligação a RNA e DNA que se localiza em paraspeckles e participa da regulação transcricional, do splicing de pré‑mRNA e do processamento de RNA. A p54/nrb forma complexos com outros membros da família DBHS para coordenar programas de expressão gênica e pode influenciar respostas a danos no DNA por meio de funções no reparo de quebras de dupla fita e na estabilidade do genoma. Por meio dessas atividades, a NONO contribui para o controle da progressão do ciclo celular, da transcrição adaptativa ao estresse e da arquitetura nuclear. A desregulação de redes de regulação de RNA associadas à NONO tem sido relacionada na literatura a sinalização proliferativa alterada e a estados aberrantes de expressão gênica relevantes para a biologia do câncer e mecanismos de doenças neurológicas.

p54/nrb O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Nono sem alterar a sequência de ADN subjacente.

p54/nrb O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Nono em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Nono, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de p54/nrb. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Nono nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de p54/nrb no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via p54/nrb em células tumorais com expressão de Nono silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.