osteocalcin Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400299-ACT

BGLAP codifica a osteocalcina, uma proteína da matriz extracelular dependente de vitamina K e γ-carboxilada, secretada por osteoblastos e incorporada à matriz óssea mineralizada. A osteocalcina participa da formação e remodelação ósseas ao influenciar a deposição de hidroxiapatita, a maturação mineral e o acoplamento osteoblasto–osteoclasto, sendo comumente utilizada como marcador de diferenciação osteogênica. Sua expressão é regulada por redes de sinalização osteogênicas, incluindo programas transcricionais conduzidos por RUNX2 e vias ligadas ao metabolismo mineral. A desregulação da expressão ou do processamento de BGLAP/osteocalcina está associada a estados alterados de remodelação óssea e fornece uma leitura funcional em estudos do desenvolvimento esquelético e de mecanismos de doenças musculoesqueléticas.

osteocalcin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de BGLAP sem alterar a sequência de ADN subjacente.

osteocalcin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus BGLAP em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição BGLAP, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de osteocalcin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus BGLAP nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de osteocalcin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via osteocalcin em células tumorais com expressão de BGLAP silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.