ORP-8 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405318-ACT

OSBPL8 codifica a proteína 8 relacionada à proteína de ligação a oxisteróis (ORP-8), um fator de transferência de lipídios e de detecção de esteróis que ajuda a coordenar a distribuição celular de colesterol e fosfolipídios em sítios de contato entre membranas, especialmente entre o retículo endoplasmático e outras organelas. A ORP-8 contribui para a regulação do metabolismo lipídico, da composição de membranas e de processos de sinalização ligados ao manejo de fosfoinositídeos e ao tráfego vesicular, moldando a homeostase celular sob condições variáveis de nutrientes ou de estresse. Alterações na atividade da ORP-8 têm sido estudadas em contextos que envolvem desregulação do processamento de lipídios e sinalização inflamatória, frequentemente implicadas na biologia de doenças metabólicas e cardiovasculares, bem como na remodelação metabólica associada a tumores. Em modelos de células humanas, a modulação de ORP-8 é, portanto, relevante para dissecar o crosstalk entre vias impulsionado por lipídios que influencia a proliferação, as respostas ao estresse e a comunicação entre organelas.

ORP-8 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de OSBPL8 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ORP-8 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus OSBPL8 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição OSBPL8, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ORP-8. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus OSBPL8 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ORP-8 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ORP-8 em células tumorais com expressão de OSBPL8 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.