ORC2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402746-ACT

O ORC2 humano codifica uma subunidade central do complexo de reconhecimento da origem (ORC), que se liga às origens de replicação e coordena a montagem do complexo pré-replicativo, garantindo a síntese de DNA uma única vez por ciclo celular. O ORC2 atua na interface entre a regulação da cromatina e o licenciamento da replicação, integrando-se com CDC6, CDT1 e o carregamento da helicase MCM durante a fase G1, além de apoiar a entrada na fase S e a estabilidade do genoma. A perturbação da atividade de ORC2 pode comprometer o timing de replicação e a progressão das forquilhas, elevando o estresse replicativo e as respostas a danos no DNA, frequentemente acionadas em distúrbios proliferativos. Como determinante central da competência das origens de replicação, o ORC2 é amplamente estudado no controle do ciclo celular, no metabolismo do DNA associado à cromatina e nos mecanismos que protegem a integridade genômica.

ORC2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ORC2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ORC2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ORC2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ORC2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ORC2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ORC2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ORC2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ORC2 em células tumorais com expressão de ORC2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.