OPN1MW2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-418725-ACT

OPN1MW2 codifica uma opsina de cone sensível a comprimentos de onda médios, expressa nos fotorrecetores cones da retina, onde se liga ao 11-cis-retinal para formar um GPCR ativado pela luz que inicia a fototransdução. Após a absorção de um fotão, a opsina ativada acopla-se à transducina (GNAT2) para regular os níveis de cGMP via atividade de fosfodiesterase, promovendo o fecho dos canais regulados por cGMP e a hiperpolarização dos cones. Esta via sustenta a discriminação de cores e a acuidade visual em condições de luz diurna através de uma modulação precisa da sinalização e da adaptação dos cones. Variações no cluster génico OPN1MW estão associadas a défices hereditários da visão das cores e a alterações da sensibilidade espectral, tornando o OPN1MW2 relevante para o estudo de relações genótipo–fenótipo na biologia da retina.

OPN1MW2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de OPN1MW2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

OPN1MW2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus OPN1MW2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição OPN1MW2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de OPN1MW2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus OPN1MW2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de OPN1MW2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via OPN1MW2 em células tumorais com expressão de OPN1MW2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.