OBFC1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405050-ACT

STN1 codifica OBFC1, uma subunidade central do complexo CST (CTC1–STN1–TEN1), que se liga ao DNA de fita simples e coordena a proteção das extremidades dos telômeros com respostas ao estresse replicativo em todo o genoma. OBFC1 sustenta a síntese de preenchimento da fita C telomérica e promove a progressão adequada da forquilha de replicação, ajudando a prevenir o acúmulo excessivo de DNA de fita simples e a sinalização aberrante de dano ao DNA. Por meio de interações com a DNA polimerase α/primase e de comunicação com vias de checkpoint dependentes de ATR, OBFC1 contribui para o reinício da replicação e para a manutenção da estabilidade cromossômica. A desregulação de componentes do CST tem sido associada a defeitos no comprimento dos telômeros, aumento da instabilidade genômica e suscetibilidade a distúrbios que apresentam replicação do DNA e manutenção telomérica prejudicadas.

OBFC1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de STN1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

OBFC1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus STN1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição STN1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de OBFC1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus STN1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de OBFC1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via OBFC1 em células tumorais com expressão de STN1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.