Ob Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400706-ACT

O LEP humano codifica a adipocina leptina (Ob), um regulador endócrino central do balanço energético que comunica ao hipotálamo o estado nutricional do tecido adiposo para modular o apetite e o gasto energético. A sinalização da leptina é mediada principalmente pela ativação de JAK2/STAT3 dirigida pelo LEPR e interage com as vias PI3K–AKT e MAPK, influenciando a homeostase da glicose, o metabolismo de lipídios e a função neuroendócrina. Em tecidos periféricos, a leptina também molda processos imunes e inflamatórios, ligando o estado metabólico à sinalização por citocinas e à atividade de células imunes. A expressão desregulada de LEP ou a resistência à leptina está associada a fenótipos metabólicos relacionados à obesidade e a uma biologia mais ampla de doenças cardiometabólicas e inflamatórias, tornando o LEP um nó central para estudos mecanísticos.

Ob O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de LEP sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Ob O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus LEP em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição LEP, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Ob. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus LEP nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Ob no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Ob em células tumorais com expressão de LEP silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.