Plasmide CRISPR d'Activation (h) Nur77: sc-418320-ACT

NR4A1 code pour le récepteur nucléaire orphelin Nur77, un facteur de transcription « immediate-early » qui relie rapidement les signaux extracellulaires à des programmes d’expression génique contrôlant le destin cellulaire. Nur77 intègre les signalisations en aval des voies MAPK, PI3K/AKT et dépendantes du calcium afin de réguler l’apoptose, la prolifération et l’adaptation métabolique, et il peut moduler des réseaux transcriptionnels inflammatoires via un dialogue (crosstalk) avec NF-κB et AP-1. Dans les cellules immunitaires, Nur77 est un régulateur clé de l’activation, de la tolérance et de la différenciation induites par le récepteur des lymphocytes T, influençant les programmes de cytokines et les réponses au stress. Une expression ou une activité dérégulée de NR4A1 a été associée à des affections inflammatoires et à la biologie des cancers, ce qui en fait un nœud mécanistique pertinent pour des recherches centrées sur les voies de signalisation.

Nur77 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NR4A1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Nur77 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NR4A1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NR4A1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Nur77. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NR4A1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Nur77 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Nur77 dans les cellules tumorales présentant une expression de NR4A1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.