NUMB Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-421991-ACT

A proteína NUMB de camundongo é um adaptador endocítico que atua como determinante do destino celular ao regular a divisão celular assimétrica e o tráfego de receptores. Ela antagoniza a sinalização de Notch e modula vias ligadas à ubiquitinação e à endocitose, influenciando assim a proliferação, a diferenciação e a manutenção de células-tronco/progenitoras em múltiplos tecidos. A NUMB também se integra a programas de polaridade e adesão por meio de interações com a maquinaria endocítica e complexos de sinalização, moldando o padrão do desenvolvimento e decisões de linhagem neuronal. A desregulação da expressão ou atividade de NUMB tem sido associada a estados de diferenciação alterados e a redes de sinalização relacionadas a tumores, tornando-a um nó útil para estudos mecanísticos de vias relevantes ao desenvolvimento e a doenças.

NUMB O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Numb sem alterar a sequência de ADN subjacente.

NUMB O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Numb em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Numb, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de NUMB. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Numb nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de NUMB no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via NUMB em células tumorais com expressão de Numb silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.