Nodal Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401439-ACT

O NODAL humano codifica o morfógeno secretado Nodal, um ligante da superfamília TGF-β que sinaliza por meio de receptores de activina e de SMAD2/3 para regular a especificação das camadas germinativas, a formação dos eixos corporais e a manutenção de programas transcricionais do desenvolvimento. A atividade de Nodal é rigidamente controlada por retroalimentação com antagonistas como as proteínas LEFTY e por interações com as vias WNT e FGF, moldando decisões de destino celular e transições epitélio–mesênquima. A reativação aberrante da via NODAL tem sido associada a estados de diferenciação alterados e a fenótipos invasivos em diversos contextos tumorais, sustentando seu uso como um nó mecanístico em modelos de desenvolvimento e de doença. Como ligante de via, Nodal fornece um readout tratável para estudar sinalização parácrina, transcrição dependente de SMAD e plasticidade de linhagem em sistemas de células humanas.

Nodal O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de NODAL sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Nodal O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus NODAL em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição NODAL, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Nodal. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus NODAL nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Nodal no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Nodal em células tumorais com expressão de NODAL silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.