NOD1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402402-ACT

NOD1 (dominio di oligomerizzazione legante nucleotidi contenente 1) è un recettore citosolico di riconoscimento di pattern (pattern-recognition receptor) che rileva muropeptidi derivati dal peptidoglicano, in particolare l’acido γ-D-glutamil-meso-diaminopimelico dei batteri Gram-negativi. In seguito al riconoscimento del ligando, NOD1 segnala attraverso RIPK2 attivando le vie di NF-κB e MAPK, promuovendo la trascrizione di mediatori infiammatori e modellando la barriera epiteliale e le risposte immunitarie innate. NOD1 interagisce inoltre con l’autofagia, la segnalazione da stress e le interazioni ospite–microbioma che influenzano la sopravvivenza cellulare e l’omeostasi immunitaria. Un’attività disregolata di NOD1 è stata associata a stati infiammatori cronici e a patologie legate alle infezioni, sostenendone lo studio nelle reti di segnalazione immunitaria e nei modelli di infiammazione rilevanti per la malattia.

NOD1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NOD1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NOD1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NOD1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NOD1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NOD1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NOD1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NOD1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NOD1 nelle cellule tumorali con espressione di NOD1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.