Nicotinic Acetylcholine Receptor delta/CHRND Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404001-ACT

CHRND codifica la subunità delta del recettore nicotinico dell’acetilcolina (nAChR) di tipo muscolare, un canale ionico regolato da ligando che si assembla a livello della giunzione neuromuscolare per mediare una rapida trasmissione sinaptica. In seguito al legame dell’acetilcolina, il recettore si apre consentendo l’ingresso di cationi, collegando la neurotrasmissione alla depolarizzazione di membrana e ai processi di eccitazione–contrazione. CHRND contribuisce all’assemblaggio del recettore, al gating del canale e alla stabilità postsinaptica all’interno delle vie di segnalazione colinergiche. Alterazioni nella composizione o nella funzione delle subunità dell’nAChR sono rilevanti per i disturbi della trasmissione neuromuscolare, supportandone l’impiego negli studi di biologia sinaptica e biogenesi dei recettori.

Nicotinic Acetylcholine Receptor delta/CHRND Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CHRND senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Nicotinic Acetylcholine Receptor delta/CHRND Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CHRND nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CHRND, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Nicotinic Acetylcholine Receptor delta/CHRND. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CHRND nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Nicotinic Acetylcholine Receptor delta/CHRND nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Nicotinic Acetylcholine Receptor delta/CHRND nelle cellule tumorali con espressione di CHRND silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.