NHE-9 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-410416-ACT

SLC9A9 codifica o trocador endossomal de Na+/H+ NHE-9, uma proteína transmembrana multipasso que regula o pH luminal e a homeostase de sódio em endossomos de reciclagem e de triagem. Ao modular a acidificação endossomal, o NHE-9 influencia o tráfego de receptores, a dissociação ligante–receptor e o equilíbrio entre reciclagem e degradação lisossomal, moldando assim as saídas de sinalização e a composição de proteínas de membrana. Essa função conecta o SLC9A9 a redes de transporte vesicular e a processos dependentes de pH que afetam a atividade sináptica, a regulação de transportadores de nutrientes e as respostas celulares ao estresse. Alterações na expressão de SLC9A9 ou no controle do pH endossomal têm sido associadas a fenótipos do neurodesenvolvimento e a outras condições ligadas a tráfego e sinalização disfuncionais.

NHE-9 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SLC9A9 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

NHE-9 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SLC9A9 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SLC9A9, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de NHE-9. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SLC9A9 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de NHE-9 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via NHE-9 em células tumorais com expressão de SLC9A9 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.